草銨膦（Phosphinothricin，PPT），是一種有機(jī)磷類(lèi)除草劑（basta的活性成分），其有效成分是膦絲菌素（PPT）。

 

草銨膦主要通過(guò)抑制谷氨酰胺合成酶（GS）活性，使植物體內(nèi)氮代謝紊亂、細(xì)胞內(nèi)氨的含量過(guò)高而中毒、葉綠素解體、 

 

光合作用受到抑制，最終導(dǎo)致植物死亡。

 

谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內(nèi)唯一能降解氨毒的酶，能夠去除植物體內(nèi)因硝酸還原反應(yīng)、氨基降解反應(yīng)和光呼吸

 

反應(yīng)過(guò)程所釋放的氨。 

草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因Bar，從土壤吸水鏈霉菌中分離克隆而來(lái)，其編碼的草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）對(duì)草銨膦專(zhuān)一性高，

 

它可以催化PPT的自由氨基乙?；?，使PPT不能抑制GS的活性，含有該基因的植物具有對(duì)Basta的抗性。

 

利用Basta篩選轉(zhuǎn)基因植物主要有兩種方法。一種是在幼苗長(zhǎng)出葉片之后直接向待篩選植株噴施Basta，另一種是在MS培養(yǎng)基

 

中加入適當(dāng)濃度的Basta。培養(yǎng)皿中央點(diǎn)野生型種子作為對(duì)照，其余部分點(diǎn)突變體種子，水平放置培養(yǎng)。

 

挑選發(fā)芽較好的幼苗，移栽到土壤中作為候選突變體培養(yǎng)。不同的植物對(duì)于Basta的敏感程度不同，同一植物不同生長(zhǎng)階段

 

對(duì)于Basta的敏感程度也不同。臨界篩選濃度的判定標(biāo)準(zhǔn)：以野生型幾乎不能發(fā)芽或者發(fā)芽不能存活的basta濃度。

 

根據(jù)擬南芥幼苗的黃化程度和死亡率確定出basta最佳篩選濃度。

10%Basta 除草劑（CB2471）即為含量10%的草銨膦溶液，使用時(shí)用去離子水稀釋?zhuān)Y選植株噴施一般工作濃度為0.001-0.002%

應(yīng)用案例(轉(zhuǎn)基因的小麥幼胚/愈傷組織篩選

1.使用草銨膦(PPT)或雙丙氨膦進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選

2.粒子轟擊(bombardment)后將未成熟幼胚逐個(gè)轉(zhuǎn)移到E3培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)14天

3.胚胎轉(zhuǎn)移到含5ug/ml PPT(或雙丙氨膦)的MSCB5培養(yǎng)基(第一輪篩選用培養(yǎng)基),黑暗培養(yǎng)二周;

 

  而這二周內(nèi)不能正常生長(zhǎng)的愈傷組織扔棄

4.用解剖刀將在MSCB5培養(yǎng)基上增值的細(xì)胞簇解離,亞克隆,轉(zhuǎn)移到含10ug/ml PPT(或雙丙氨膦)的MSCB10培養(yǎng)基, 維持培養(yǎng)4周

5.在含5ug/ml PPT或10ug/ml PPT(或雙丙氨膦)的培養(yǎng)基上篩選過(guò)程的持續(xù)周期約50-75天,將所有培養(yǎng)物放到植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱

 

  內(nèi),設(shè)置25度,黑暗培養(yǎng),每一個(gè)轉(zhuǎn)基因愈傷組織在含有篩選標(biāo)的培養(yǎng)基上最終生長(zhǎng)為大量的胚胎愈傷組織

6.設(shè)置1-10ug/ml PPT(或雙丙氨膦)的梯度濃度來(lái)測(cè)試未轉(zhuǎn)化愈傷組織,以建立更加有效的篩選系統(tǒng),每一次實(shí)驗(yàn)大概準(zhǔn)備20個(gè)

 

  目標(biāo)培養(yǎng)平板,2各為對(duì)照,1個(gè)在N6C1上生長(zhǎng)以監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的健康情況,另一個(gè)在含5-10ug/ml雙丙氨膦的N6C1上生長(zhǎng)以驗(yàn)證

 

  未轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)選擇標(biāo)志的反應(yīng)

 

注意：

轉(zhuǎn)基因小麥愈傷組織的選擇實(shí)驗(yàn)中雙丙氨膦是有效的篩選標(biāo)志，然而雙丙氨膦不能殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

 

為了得到理想的篩選效果，建議低密度（大概每個(gè)平板上10個(gè)未成熟幼胚）亞培養(yǎng)粒子轟擊后的細(xì)胞。