ReadyPour™  20% Bis Tris  Solution是一種Acrylamide膠預(yù)混液，該預(yù)混液安全、快速、操作簡單、解析度高

本品已預(yù)先配制成 20% 分離膠液體，按照百分之一的比例加入相應(yīng)量的 10%過硫酸銨或其替代物溶液

按照千分之一的比例加入相應(yīng)量的 TEMED。

例如 10ml 12% SDS-PAGE 分離膠預(yù)混液中，加入 100μl 10%過硫酸銨和 10μl TEMED

即可直接灌膠，能在10分鐘以內(nèi)完成凝膠（夏季3-5分鐘）

凝膠時間快，無須再自行配置並節(jié)省時間

 

 

注意：

1.APS和TEMED品質(zhì)的好壞會影響凝膠時間，請用新鮮配制的APS;

2.由于凝膠速度快,請勿比照傳統(tǒng)制膠方式采用槍頭轉(zhuǎn)移進(jìn)行灌膠;

3.灌入分離膠后記得取起制膠架輕輕拍敲桌面以利膠體鍵結(jié)緊實;

4.分離膠與濃縮膠之間無須用水壓平,因此灌上層濃縮膠時不要在固定位點擠壓灌膠;

5.抽拔齒梳時, 齒梳左右二邊一定要平,輕緩慢慢拔起;

 

操作方式:

1.在擠壓瓶中加入相應(yīng)比例TEMED和APS后即可進(jìn)行灌膠

  (等同傳統(tǒng)計算方式:TEMED為配膠總體積的千分之一,APS為配膠總體積的百分之一)

2.取分離膠擠壓瓶在玻璃板中空縫隙中選擇一位點擠壓灌入制作分離膠,

3.然后將整座制膠架取起,輕輕拍敲桌面兩下即可

 

分離膠擠壓瓶中的剩余預(yù)混液凝結(jié)成果凍狀后,即代表已凝膠 

用于制備SDS Page凝膠或WB實驗?zāi)z

 

學(xué)習(xí)Western Blot技術(shù)，首先要學(xué)習(xí)的就是手灌膠技術(shù)。

手灌膠技術(shù)是WB實驗中最基本的技術(shù)，雖然現(xiàn)在預(yù)制膠橫行天下

但是對于某些特定蛋白或比較極端分子量的蛋白，

預(yù)制膠達(dá)不到好的分離效果

有些表達(dá)量極低的蛋白預(yù)制膠膠孔達(dá)不到足夠上樣量

我們就需要根據(jù)待分離蛋白的特性來配制聚丙烯酰胺凝膠

 

傳統(tǒng)制膠及步驟繁瑣之處:

（1）手灌膠各成分介紹；

 

a.丙烯酰胺：形成聚丙烯酰胺的基本物質(zhì)，具有神經(jīng)毒性及致癌性（WB所用試劑幾乎都具有強毒性，做好實驗的前提，先要保護(hù)好自己）；

b.Tris-Hcl:在蛋白電泳中與Gly構(gòu)成緩沖體系，穩(wěn)定電泳過程中的PH穩(wěn)定，Tris（氨丁三醇）可致癌；

c.過硫酸銨（AP）：相當(dāng)于催化劑作用，提供兩種丙烯酰胺聚合所必須的自由基；

d.TEMED（四甲基二乙胺）:催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)，促進(jìn)聚丙烯酰胺凝膠形成（凝固劑）,具有強烈刺激性氣味（惡臭），并具強神經(jīng)毒性；

e.SDS（十二烷基硫酸鈉）：能使蛋白變性，具有呼吸刺激性。

（2）常用分離膠濃度與最佳分離范圍；

分離膠濃度	最佳分離范圍（kD）
6%	50—150/60-220
8%	30—90
10%	20—80
12%	12—60
15%	10–40

備注：分離膠濃度越大，最佳分離蛋白分子量越小。

（3）分離膠配制(兩塊膠量—10ml)；

成分	分離膠濃度
	6%	8%	10%	12%	15%
超純水	5.3ml	4.6ml	4ml	3.3ml	2.3ml
30%丙烯酰胺	2ml	2.7ml	3.3ml	4ml	5ml
1.5M Tris（PH8.8）	2.5ml	2.5ml	2.5ml	2.5ml	2.5ml
10%SDS	100μl	100μl	100μl	100μl	100μl
10%AP	100μl	100μl	100μl	100μl	100μl
TEMED	4μl	4μl	4μl	4μl	4μl

備注：我們所說的膠濃度，實際是指丙烯酰胺濃度。

（4）濃縮膠配制：

成分	4ml量	6ml量
超純水	2.7ml	4.1ml
30%丙烯酰胺	660μl	1.0ml
1.5M Tris（PH6.8）	500μl	750μl
10%SDS	40μl	60μl
10%AP	40μl	60μl
TEMED	4μl	6μl

備注：濃縮膠一般使用2—3ml即可，濃度一般使用5%。

（5）聚丙烯酰胺凝膠配制：

a.檢漏，選取清洗干凈的模具玻璃，固定于膠固定器上，加入超純水，檢查模具是否漏液；

b.配制分離膠，按所需濃度配制分離膠，配制過程中最后加入TEMED，混勻后灌入模具，防止產(chǎn)生氣泡，并注意高度，最后輕輕加入超純水封口，使液面平整，凝固速度受室溫影響，溫度越高，凝固越快，冬天可放入孵箱中加速凝固；

c.待水和膠之間出現(xiàn)一道折線時，說明膠已凝固，此時，將水倒出，并用吸水紙吸干殘余水分；

d.濃縮膠配制，按需量配制濃縮膠，同樣最后加入TEMED，灌入分離膠上面，灌滿模具，排氣泡后插入所需梳子，待膠凝固。

膠一般提前一天配制，配制完成后，可泡到電泳液中，存放于4℃冰箱保存，第二天使用。

手灌膠技術(shù)是WB的基礎(chǔ)入門級技術(shù)，相對于昂貴的預(yù)制膠，手灌膠性價比更高，對某些蛋白分離效果更好。

系統(tǒng)的掌握WB技術(shù)，依賴于預(yù)制膠遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，預(yù)制膠雖然節(jié)省了配膠的時間，但還是有特殊蛋白需要手灌膠進(jìn)行分離。

采用快速凝膠 20% 下層分離膠預(yù)混液簡易之處: 

擠壓瓶中加入相應(yīng)比例TEMED和APS后(等同傳統(tǒng)計算方式),即可進(jìn)行灌膠,取分離膠擠壓瓶在玻璃板中空縫隙中選擇

一位點擠壓灌入制作分離膠,然后將整座制膠架取起,輕輕拍敲桌面兩下即可